А. Исследование гуморального иммунитета. Методы оценки состояния гуморального и клеточного иммунитета. Оценка иммуного статуса организма. Изучение гуморального звена иммунитета
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Введение
Клеточный иммунитет (англ. Cell-mediated immunity ) - это такой тип иммунного ответа, в котором не участвуют ни антитела, ни система комплемента. В процессе клеточного иммунитета активируются макрофаги, натуральные киллеры, антиген-специфичные цитотоксические Т-лимфоциты, и в ответ на антиген выделяются цитокины.
Иммунная система исторически разделена на две части - систему гуморального иммунитета и систему клеточного иммунитета. В случае гуморального иммунитета, защитные функции выполняют молекулы, находящиеся в плазме крови, но не клеточные элементы. В то время как в случае клеточного иммунитета защитная функция связана именно с клетками иммунной системы. Лимфоциты кластера дифференцировки CD4 или Т-хелперы осуществляют защиту против различных патогенов.
Система клеточного иммунитета выполняет защитные функции следующими способами:
· путём активации антиген-специфических цитотоксичных Т-лимфоцитов, которые могут вызывать апоптоз соматических клеток, демонстрируя на поверхности эпитопы чужеродных антигенов, например, клеток, заражённых вирусами, содержащими бактерии и клеток опухолей, демонстрирующих опухолевые антигены;
· путём активации макрофагов и натуральных киллеров, которые разрушают внутриклеточные патогены;
· путём стимулирования секреции цитокинов, которые оказывают влияние на другие клетки иммунной системы, принимающие участие в адаптивном иммунном ответе и врождённом иммунном ответе.
Клеточный иммунитет направлен преимущественно против микроорганизмов, которые выживают в фагоцитах и против микроорганизмов, поражающие другие клетки. Система клеточного иммунитета особенно эффективна против клеток, инфицированных вирусами, и принимает участие в защите от грибов, простейших, внутриклеточных бактерий и против клеток опухолей. Также система клеточного иммунитета играет важную роль в отторжении тканей.
Выделяют три вида методов оценки клеточного иммунитета, о которых речь пойдет далее.
Определение количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-супрессоров и лимфоцитов-киллеров
Проводится с помощью иммунофлюоресцентного метода и моноклональных антител к поверхностным рецепторам этих клеток: CD3+ все Т-лимфоциты, СВ 4+-хелперы, СВ 8+-супрессоры, СО 16+-киллеры. До недавнего времени для количественной характеристики Т-лимфоцитов и их подклассов (хелперов, супрессоров, киллеров) использовался тест розеткообразования, т.е. способность лимфоцитов формировать розетки с эритроцитами барана. Однако в настоящее время этот тест утрачивает свое значение, уступая место менее сложному и более специфичному иммунофлюоресцентному методу с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам лимфоцитов. Упоминание здесь о тестах розеткообразования обусловлено тем, что некоторые результаты, о которых речь пойдет далее, получены с их помощью.
Иммунофлуоресцентный анализ (МФА - метод флуоресцирующих антител , иммунофлуоресценция ) (англ. Immunofluorescence ) - набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных, так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer ) или микрочипового цитометра (сhip cytometer ). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging , high-content cytometry , high-content screening ) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.
Сущность и классификация метода . Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск.. [ 1] В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру, DAPI), РНК (к примеру, Sybr Green II), липидам и белкам.
В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом, [ 2] и непрямой , разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом .
При прямом методе (пМФА ) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.
При непрямом методе (нМФА ) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. "первые" антитела), а затем видоспецифичные "вторые" антитела против "первых" антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве "первых" антител используются мышиные антитела - mouse IgG, то в качестве "вторых" используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со "вторым" антителом.
Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.
Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.
Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых "крестах" (от одного + до четырёх ++++) - субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.
Значение и перспективы метода . Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например, определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging ) и высокоинформативной цитометрии (high content cytometry) , параллельно развивающиеся с 90-х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией в которых отдельные антитела метятся наночастицами.
Метод моноклональных антител. Моноклональные антитела - антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной клетки-предшественницы. Моноклональные антитела распознают и связывают антигены для распознавания специфических эпитопов, которые обеспечивают защиту против болезнетворных организмов.
Моноклональные антитела связывают различные белки, которые влияют на активность клеток, такие как рецепторы или другие белки, представленные на поверхности нормальных и раковых клеток. Специфичность моноклональных антител позволяет им связывать раковые клетки и, взаимодействуя с цитотоксическими агентами, такими как сильная радиоактивы, разрушают раковые клетки, не повреждая здоровые.
Раковые клетки, которые способны реплицироваться бесконечно, сливаются с клетками млекопитающих, которые продуцируют специфические антитела, что приводит к образованию гибридом, постоянно продуцирующих антитела. Эти антитела называют моноклональными, которые происходят из одного типа клеток, т.е. из клеток-гибридом. Антитела, получаемые с помощью традиционных методов, получают из клеток различного типа и называют поликлональными.
Моноклональные антитела искусственно производят против специфических антигенов, для связи с антигенами-мишенями. Лабораторное производство моноклональных антител, основанное на получении антигенов из одной клетки, позволяет получать идентичные друг другу моноклональные антитела.
При слиянии культур миеломных клеток с антителами клеток селезенки млекопитающих образуются гибридные клетки/ гибридомы, которые производят моноклональные антитела в большом количестве. Слияние клеток приводит к образованию двух типов клеток, один тип способен расти постоянно, другой тип способен производить чистые антитела в больших количествах. Гибридные клетки производят только одно лучшее антитело, более чистое, чем поликлональные антитела, получаемые с помощью традиционных методик. Моноклональные антитела являются гораздо более эффективными методами, чем традиционные методы лечения, поскольку эти методики воздействуют не только на инородную субстанцию, но и на собственные клетки организма, что вызывает сильные побочные эффекты. Моноклональные антитела взаимодействуют только с инородными антителами/ клетками-мишенями, не оказывая или оказывая минимальные побочные эффекты.
Присутствие большого количества специфических моноклональных антител в крови говорит о присутствии в организме аномального белка. Как правило, этот белок может быть обнаружен в процессе клинического обследования и идентифицирован с помощью скринингового анализа крови, например, с помощью белкового электрофореза. Источником аномального производства моноклональных антител является популяция плазматических клеток в костном мозге.
Антивирусные (9 продуктов): ANT-143 (анти-денге тип 2), ANT-150 (вирус гепатита В), ANT-156 (вирус гепатита С NS3), ANT-158 (вирус гепатита D), ANT-152 (HIV-1 p24), ANT-159(HIV-1 gp41), ANT-151 (HIV-1 gp120), ANT-153 (HIV-2 gp39), ANT-178 (нуклеокапсидный белок SARS), ANT-179 (SARS Spike).
Анти-мышиные лимфоциты (9 продуктов): ANT-175 (CD3), ANT-165 (CD4), ANT-136 (CD11b-FITC), ANT-135 (CD11a), ANT-133, ANT-142 (CD90 Thy-1), ANT-140 (CD90 Thy-1.1), ANT-141 (CD90 Thy-1.2), ANT-139 (B220)
Анти-мышиные цитокины (8 продуктов): ANT-116 (CTLA-4), ANT-105 (интерлейкин-2), ANT-103 (рецептор интерлейкина-2), ANT-108 (интерлейкин-4), ANT-113 (интерлейкин-10), ANT-114 (интерлейкин-12p40), ANT-209 (интерлейкин-12p75), ANT-166 (IFN-гамма).
Античеловеческие лимфоциты (12 продуктов): ANT-206 (CD1A), ANT-207 (CD2), ANT-144 (CD3), ANT-137 (CD3-FITC), ANT-138 (CD3-биотинилированный), ANT-145 (CD4), ANT-132(CD4-FITC), ANT-167(CD4-биотинилированный), ANT-171 (CD5), ANT-148 (CD8), ANT-131 (CD8-FITC), ANT-134 (CD8-биотинилированный).
Античеловеческие хемокины (9 продуктов): ANT-126 (эотаксин-1), ANT-127 (эотаксин-2), ANT-119 (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор), ANT-120 (хемотоксический фактор-3 макрофагов-моноцитов), ANT-118 (воспалительный белок макрофагов-1a), ANT-121 (воспалительный белок макрофагов-3), ANT-212 (белок воспаления макрофагов-3), ANT-212 (b) (белок воспаления макрофагов-3 бета), ANT-170 (фактор активации нейтрофилов).
Античеловеческие цитокины (28 продутов): ANT-128 (нейротропный фактор головного мозга), ANT-183 (белок морфогенеза костей-2), ANT-169 (эпидермальный фактор роста), ANT-187 (эритропоэтин), ANT-196 (эритропоэтин клон NYRhEPO), ANT-204 (анти-FAS-антитело), ANT-205 (FAS-активирующее антитело), ANT-197 (гормон роста), ANT-129 (КОЕ макрофагов-гранулоцитов), ANT-184 (КОЕ гранулоцитов), ANT-122 (нейтрализатор интерферона-альфа), ANT-208, ANT-185 (интерферон-бета), ANT-123 (интерферон-гамма), ANT-102(интерлейкин-2), ANT-104 (рецептор интерлейкина-2), ANT-106 (интерлейкин-3), ANT-107 (интерлейкин-4), ANT-109 (интерлейкин-6), ANT-110 (интерлейкин-7), ANT-111(интерлейкин-8), ANT-112 (интерлейкин-10), ANT-115 (интерлейкин-15), ANT-172 (лептин), ANT-117 (нейротрофин-4), ANT-124 (фактор некроза опухолей-альфа), ANT-168(трансфоримрующий фактор роста-бета), ANT-125 (фактор роста ЭПР).
Другие антитела: (25 продуктов): ANT-191 (СD20), ANT-130 (хламидия LPS), ANT-211 (c-Myc), ANT-146 (FLAG), ANT-186 (Neisseria Gonorrhea), ANT-176 (H-2K), ANT-101 (HA-tag белок),ANT-194 (поверхностный антиген Ck вируса гепатита В), ANT-147 (hCG beta core), ANT-149 (лизозим Hen Egg), ANT-154 (гепараназа человека-1 3/17), ANT-202 (легкие цепи каппа Ig),ANT-203 (легкие цепи лямбда Ig), ANT-193 (гепараназа человека-1 130), ANT-201 (IgA 1&2), ANT-174 (компонент IgA Sec), ANT-173 (IgG-Fc), ANT-100 (инсулин), ANT-177 (белок, связывающий мальтозу), ANT-199 (миелин олигонуклецит гликопротеин), ANT-198 (Staphylococcus aureus, устойчивый к метициллину), ANT-192 (p53 scFv), ANT-200 (фосфолипидный белок миелина), ANT-195 (anti-Tetanus Toxoid scFv), ANT-164 (глутатион-S-трансфераза).
Лейкоцитарные тесты. Лейкоцитарные тесты - группа диагностических тестов, в которых показателем для оценки специфической реактивности организма и функции иммунной системы служат изменения различных свойств лейкоцитов. К лейкоцитарным относятся тест розеткообразования, бластотрансформация лимфоцитов, торможение миграции макрофагов, аллергическая альтерация лейкоцитов и тест с глюкокортикоидрезистентной фракцией лимфоцитов.
Тест розеткообразования основан на различиях рецепторной структуры лейкоцитов (лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов), которые при взаимодействии с эритроцитами могут спонтанно присоединять последние к своей поверхности. При этом образуются фигуры, напоминающие розетки, в центре которых находится лейкоцит, а вокруг него располагаются не менее 3-5 эритроцитов. Существует несколько вариантов этого теста. При прямом тесте в формировании розеток участвуют антигены самих эритроцитов, а при непрямом - антигены, искусственно фиксированные на поверхности эритроцитов. При прямом тесте образуются спонтанные и иммунные розетки: спонтанные розетки - между лимфоцитами человека или животных и эритроцитами барана; иммунные - с эритроцитами, использованными для иммунизации донора лейкоцитов. Прямой тест используют для определения количества Т-лимфоцитов (т.к. эти клетки несут рецепторы к эритроцитам барана), широко применяют для оценки иммунного статуса, а в некоторых случаях - для выделения В-клеток. Розетки могут формироваться за счет иммуноглобулинов, которые образуются в В-клетках или фиксируются на клетках (гранулоцитах, моноцитах). Феномен розеткообразования может возникать не только с эритроцитами, но и с другими клетками и искусственными гранулами.
Сущность метода заключается в выделении взвеси лейкоцитов (лимфоцитов) обследуемого, инкубации их со взвесью эритроцитов барана (обработанных или не обработанных антигеном) и подсчета числа розеткообразующих клеток.
Бластотрансформация лимфоцитов - превращение малых зрелых лимфоцитов в малодифференцированные клетки типа бластов. Различают спонтанную и индуцированную бластотрансформацию лимфоцитов. Последняя возникает под влиянием неспецифических митогенов или специфических аллергенов (антигенов). К взвеси лейкоцитов крови добавляют раствор аллергена, смесь культивируют в течение 5-7 дней, а затем под микроскопом определяют процентное содержание лимфобластов в окрашенных мазках. Для более точной оценки бластотрансформации лимфоцитов к взвеси клеток добавляют 3 Н-тимидин, который включается в ДНК клеток. По разнице радиоактивности образцов клеток, культивированных с антигеном и без него, судят о степени специфической бластотрансформации лимфоцитов под влиянием аллергена (антигена).
Торможение миграции макрофагов происходит под влиянием специфического антигена. Существует несколько модификаций теста, наиболее распространенный - капиллярный. В лунку с питательной средой помещают отрезок капилляра, заполненный клетками, и добавляют в нее испытуемый антиген. После культивирования клеток в течение 24 ч при 37° измеряют один из параметров мигрировавших из капилляра клеток (диаметр, площадь миграции и др.). Отношение опытного параметра к контрольному (без антигена) составляет индекс миграции. Реакция считается положительной, если опытные и контрольные показатели различаются более чем на 20 %. Описаны методы оценки миграции клеток из капли агарозы, содержащей клетки, и миграции клеток из лунки под агарозу. В качестве тестируемых клеток в клинике наиболее часто используют лейкоциты крови, а в эксперименте - макрофаги и иногда лимфоциты. Тормозят миграцию клеток медиаторы, выделяющиеся из сенсибилизированных к данному антигену лимфоцитов, которые всегда присутствуют во взвеси испытуемых клеток: фактор торможения миграции макрофагов (MIF), фактор торможения миграции лейкоцитов (LIF) и др. Реакции торможения миграции макрофагов и лейкоцитов отражают состояние гиперчувствительности замедленного типа. клеточный иммунитет защитная лимфоцит
Аллергическая альтерация лейкоцитов - повреждение лейкоцитов под влиянием специфического аллергена.
Для выявления повреждения нейтрофильиых лейкоцитов используют тест ППН (показатель повреждения нейтрофилов) по Фрадкину. Кровь больных, страдающих аллергией, культивируют с аллергеном в течение 2 ч . Затем готовят мазки, которые окрашивают на гликоген с докраской ядер клеток гематоксилином. При положительном тесте наблюдается усиление амебоидной реакции нейтрофилов на аллерген, специфичный по отношению к циркулирующим в крови антителам. Амебоидная реакция сопровождается насыщением гликогеном псевдоподий клеток. Для оценки специфического повреждения лейкоцитов крови широко используется люминесцентная микроскопия. Пусковым механизмом аллергической альтерации клеток является образование комплекса, состоящего из аллергена и антител, связанных с поверхностью клеток. Альтерация лейкоцитов под влиянием специфического аллергена - показатель аллергии немедленного типа. Альтерация сопровождается не только морфологическими изменениями клеток, но и выделением из них биологически активных веществ, например освобождением гистамина.
Лейкоцитарный тест с глюкокортикоидрезистентной фракцией лимфоцитов - относительная и абсолютная величина лимфоцитов в единице объема крови, устойчивая к литическому действию глюкокортикоидов. Все лимфоциты, толерантные в условиях культивации in vitro к литическому действию глюкокортикоидов, называются глюкокортикоидрезистентными. В зависимости от используемого глюкокортикоида их называют кортизолрезистентными, кортикостеронрезистентными и т.д. Тест отражает степень активации иммунной системы под влиянием антигенной стимуляции, позволяет оценивать изменения этой активации в процессе развития заболевания и, следовательно, имеет прогностическое значение. При инфекционных, инфекционно-аллергических и аллергических заболеваниях отмечается увеличение кортизолрезистентной фракции лимфоцитов. У взрослых в норме она составляет 60-64 % или 1100-1250 лимфоцитов в 1 млк крови.
Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов
Этот тест основан на способности Т-лимфоцитов пролиферировать в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном (субстанциями, названными так из-за способности вызывать митозы в лимфоцитах) и продуцировать интерлейкины (ИЛ-1 и ИЛ-2). Необходимо отметить, что раньше пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по количеству бластов (бласттрансформация) и митозов, появляющихся в стимулированной митогеном культуре, в настоящее время - используя радиоактивную метку и ее подсчет на сцинтилляционном счетчике.
Пролиферативную активность Т-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (поликлональная стимуляция) или антигеном (моно- и олигоклональная стимуляция). В последнем случае применяются распространенные антигены или аллоантигены. Интенсивность синтеза ДНК оценивают по включению в нее меченных радиоактивным изотопом нуклеозидов, например 3Н-тимидина. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции - отношение радиоактивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов. Митогены стимулируют пролиферацию значительной части Т-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 сут. Антиген стимулирует пролиферацию только тех Т-лимфоцитов, которые несут рецептор к нему, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5-7 сут. Для оценки пролиферативной активности Т-лимфоцитов, как и при проведении кожных проб, применяют набор широко распространенных антигенов. У ВИЧ-инфицированных пролиферативная реакция Т-лимфоцитов на распространенные антигены может быть снижена уже на ранних стадиях заболевания. Прогрессирование ВИЧ- инфекции и других иммунодефицитов сопровождается снижением реакции Т-лимфоцитов на аллоантигены, а впоследствии - и на митогены. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.
Помимо того исследование Т-лимфоцитов проводят, оценивая на цитотоксичность . Обычно оценивают цитотоксичность, ограниченную по HLA, опосредованную лимфоцитами CD8. Клетками-мишенями служат собственные клетки, несущие на своей поверхности чужеродный антиген, связанный с антигенами HLA класса I. Лимфоциты CD8играют важную роль в защите от вирусных инфекций. Наряду с лимфоцитами CD8 ограниченную по HLA цитотоксичность осуществляют некоторые лимфоциты CD4, распознающие антиген в комплексе с антигенами HLA класса II. Обе субпопуляции лимфоцитов несут антигенраспознающий рецептор, образованный альфа- и бета-цепями. Лимфоциты CD8 с антигенраспознающим рецептором, образованным гамма- и дельта-цепями, участвуют в цитотоксичности, не ограниченной по HLA. Эти лимфоциты присутствуют в крови в незначительном количестве и разрушают клетки- мишени подобно NK-лимфоцитам, то есть без предварительной иммунизации. Оценка клеточной цитотоксичности необходима для диагностики иммунодефицитов. Оценку цитотоксической активности лимфоцитов проводят следующим образом:
1) клетки-мишени обрабатывают радиоактивной меткой (51Сr);
2) к меченым клеткам-мишеням добавляют исследуемые лимфоциты;
3) гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Полученные результаты сравнивают с нормальными показателями.
При исследовании ограниченной по HLA цитотоксичности исследуемые Т-лимфоциты предварительно инкубируют с антигеном, присутствующим на клетках-мишенях.
Оценка системы натуральных киллеров
Для этого используется цитотоксический тест, в котором клетками-мишенями чаще всего служит линия клеток К-562, меченная 3 Н-уридином. Тестируемые лимфоциты вносят в культуру К-562, инкубируют в присутствии РНКазы, а затем оценивают уровень радиоактивного уридина, высвободившегося из лизированных клеток-мишеней.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Формы, механизмы, органы, регуляция иммунитета. Субпопуляции Т-лимфоцитов, их функции. История открытия регуляторных Т-клеток. Эффективность микробиологической диагностики. Иммунная регуляторная система. Будущее трансплантологии, технические трудности.
контрольная работа , добавлен 11.05.2016
Основные типы лимфоцитов по функциональным и морфологическим признакам как клеток иммунной системы и ее ключевого звена. Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА. Методы выделения и изучения лимфоцитов.
курсовая работа , добавлен 07.12.2013
Иммунитет – способ защиты организма от болезнетворных микроорганизмов за счет выработки антител. Обзор схемы клеточного и гуморального иммунитета. Нарушения фагоцитарной системы. Методы оценки иммунитета. Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест.
презентация , добавлен 11.11.2014
Общая характеристика B-лимфоцитов. Характеристика субпопуляций, рецепторы и маркеры В-лимфоцитов. Антигенраспознающие рецепторы B-клеток: общая характеристика. Субпопуляции В-лимфоцитов, распознание антигенов рецепторами иммуноглобулиновой природы.
реферат , добавлен 02.10.2014
Вирусы как группа живых существ, не имеющих клеточного строения, их формы, генетические связи с представителями флоры и фауны Земли. Заражение системы клеточного иммунитета человека и сущность СПИДа. Происхождение и размножение вирусов, их вред и польза.
творческая работа , добавлен 24.02.2010
Последовательность образования антител. Дентдритные клетки и их классификация. Клетки Лангерганса, их происхождение и функции, методы выявления. Презентация антигена. Роль клеток в формировании клеточного и гуморального антивирусного иммунитета.
реферат , добавлен 09.02.2012
Понятие и виды иммунитета, назначение иммунной системы. Факторы и признаки ослабления иммунитета, методы его повышения. Механизм действия иммунитета: макрофаги, Т-хэлперы, В-лимфоциты, выработка иммуноглобулинов (антител), Т-супрессоры, клетки-киллеры.
реферат , добавлен 09.02.2009
Понятие и внутренняя структура цитокинов как важного элемента при взаимодействии разных лимфоцитов между собой и с фагоцитами. Оценка их биологической роли, характеристика и значение в организме. Варианты проявления действия цитокинов, иммунный ответ.
презентация , добавлен 22.10.2015
Специфичность и ее значение, взаимодействие антигена и антитела. Основные элементы иммунной системы организма, селекция антител, структура белковой молекулы. Теория "клональной селекции", возникновение разнообразия лимфоцитов или их предшественников.
реферат , добавлен 05.06.2010
Основные функции иммунной системы. Генез Т- и В-лимфоцитов. Общие закономерности нарушений иммунной системы. Способность организма отвечать на действие антигена клеточными и гуморальными реакциями. Процессы развития патологических процессов в организме.
У человека два типа иммунитета — клеточный и гуморальный иммунитет. Оба вида иммунитета исполняют разные функции, однако плотно связаны между собою. Поэтому разделение обоих видов относительное. Гуморальный иммунитет – способность исключить инфицирования благодаря антителам. Они присутствуют в плазме крови, слизистой органов зрения, слюне.
Этот вид иммунитета вырабатывается в утробе матери, переходит плоду через плаценту. Антитела поступают ребенку уже в течение первых месяцев жизни через молоко матери. Молоко оберегает ребенка от интенсивного влияния множественных типов микробов и микроорганизмов. Вскармливание грудью – ключевое обстоятельство развития иммунной системы малыша.
Производится защитная функция организма от инфекционных заболеваний таким образом: Когда запоминается антиген при конкретном заболевании. Если инфекция вновь попадет в организм, то антитела узнают ее и истребляют патогенные организмы. Во время прививок вводится препарат, чтобы в дальнейшем узнать антиген и поглотить его.
Гуморальный и клеточный иммунитет: особенности функций
Иммунитет клеточный оберегает от вирусных болезней, вызванных патогенными грибами, опухолей. Непосредственно этот вид берет участие в отторжении различных чужеродных тканей, аллергических откликов и производится фагоцитами. Эти клетки оберегают организм методом поглощения (фагоцитоза) чужеродных веществ, частиц, микроорганизмов. В крови присутствуют в большей мере гранулоциты и моноциты.
Первые считаются разновидностью лейкоцитов, обеспечивают защитные силы организма. Они первыми замечают воспалительный процесс.
Вторая разновидность лейкоцитов относится к крупным кровяным клеткам. Моноциты защищают от вирусов и инфекций, поглощают сгустки крови, оберегают от формирования тромбоза, борется с опухолями. Для иммунной защиты нужен процесс фагоцитоза (поглощения), когда чужеродное вещество поглощается фагоцитами.
Оба иммунитета не могут существовать и функционировать один без другого. Разница их заключается в функциональности. Когда гуморальный иммунитет борется непосредственно с микроорганизмами, то клеточный с грибком, раком и различными микробами. Для нормальной работы иммунной системы важны 2 типа иммунитета.
Для увеличения защиты, следует постоянно пить витамины, вести здоровый образ жизни. Также снижение иммунитета характеризуется постоянными недосыпаниями и нагрузками на организм. В последних вариантах понадобиться принятие препаратов регулирующих иммунную систему. Иммунитет – один с факторов самочувствия. Когда не поддерживать деятельность иммунной системы в норме, то все микробы, инфекции будут атаковать организм постоянно.
Восстановление иммунитета
Для регенерации слабой иммунной защиты изначально необходимо выяснить первопричину сбоев. Нарушение конкретных звеньев иммунной системы считается источником определенных болезней. Слабое сопротивление организма инфекциям может также указывать на проблемы с иммунитетом. Лечение заболеваний снизивших иммунитет содействуют его быстрому восстановлению. К таким болезням относится диабет, а также хронические заболевания.
Изменение образа жизни считается одним из лучших способов в решении вопроса о том как повысить гуморальный иммунитет.
Метод охватывает:
- отказ от курения и алкоголя;
- соблюдение режима сна и бодрствования;
- занятие спортом и прогулки на свежем воздухе;
- закаливание организма;
- сбалансированное питание с витаминами.
Гуморальный иммунитет результативно возобновлять с помощью приема витаминов, средств народной медицины и специальных лекарств. Любые средства по восстановлению иммунной системы назначаются иммунологом в точной дозировке, по инструкции. Прием витаминов и минералов особенно полезно весной. Ягодные морсы, мед, шиповник, алоэ могут восстановить иммунитет.
Принятие лекарственных веществ и витаминов для повышения любого вида иммунитета не даст результатов, когда не обнаружен, не ликвидирован главный фактор его снижения. Фармацевтические средства выписывает доктор. Самолечение запрещено.
Механизм гуморального иммунитета
В базе реализации гуморального иммунитета находится механизм влияния веществ, истребляющих патогенные бактерии через кровь. Подобные элементы делят на группы – специфические (помогает Энджерикс) и неспецифические. К условиям неспецифической природы причисляют клетки врожденного иммунитета, что подавляют микроорганизмы.
К группе относят:
- Сыворотка крови;
- Секреты желез, подавляющих формирование бактерий;
- Фермент лизоцим. Антибактериальный агент уничтожает хим. взаимосвязи в структуре стены патогенных организмов;
- Муцин входит в железы выделяющие слюну. Это углеводы и белки, которые называют гликопротеинами. Необычный состав дает возможность главным гликопротеинам слизи охранять клеточные слоя от воздействия токсических веществ;
- Пропердин – белок сыворотки крови из группы глобулинов, отвечает за свертывание крови;
- Цитокины – небольшие пептидные сигнальные (управляющие) молекулы. Они передают сигналы между данными клетками. Выделяют пару групп, основной из которых считается интерфероны;
- Интерфероны (аутогенные гликопротеины)– вещества белковой природы, обладающие общими защитными свойствами. Если начинается воспалительный процесс они подают сигнал. Кроме этой способности они подавляют возбудителей болезней. Выделяют ряд видов аутогенных гликопротеинов. Альфа и Бета возникают при вирусном инфицировании, а Гамма образовывается благодаря клеткам иммунитета.
Стоить рассмотреть понятие система комплемента — белковые комплексы, которые исполняет функцию обезвреживания бактерий. Система комплемента включает до двадцати белков со своим порядковым номером (C1, C2, C3 и другие).
Иммунология
Специфический отклик – одиночный фактор. Например, в детстве ребенок переболел оспой. Будучи взрослым, он не будет больше болеть данным заболеванием, поскольку уже выработался иммунитет. Также это касается всех тех прививок, которые человеку сделали в раннем возрасте.
Неспецифическая форма предполагает многоцелевую защиту, врожденную, включая отклик организма на попадание в тело инфекции.
Гуморальный иммунный ответ — синтез антител В-клетками в ответ на появление в теле человека патогенных организмов. По мере развития гуморального иммунного ответа с этапа определения антигена до более интенсивной продукции антител совершаются 2 основных действия:
- переход синтеза антител с одной разновидности в другую;
- увеличение прочности связывания активных зон антител с реакционноспособными группами антигена.
Местом формирования считаются фолликулы с дополнительной оболочкой либо места концентрации В-лимфоцитов в лимфоидной ткани. На периферии фолликул происходит определение антигена. В процесс вступает субпопуляция Т-лимфоцитов, оказывающая помощь в продукции антител. В-лимфоциты приступают усиленно делиться.
Совершается переключение иммуноглобулиновых генов, увеличивается число вероятных мутаций. На плоскости лимфоцитов возникают разные типы иммуноглобулинов класса G. В-клетки клонов в местах размножения, отбираются по признаку высокой степени сродства их рецепторов. Клетки, имеющие повышенную степень аффинности дифференцируются в:
- плазматические клетки;
- клетки, хранящие информацию о ранее действовавших антигенах.
Участие образовавшихся антител выражается в 3 формах:
- реакция нейтрализации микроорганизмов;
- усиленная фагоцитарная активность;
- активации комплекса сложных белков.
Возбудители болезней в ходе существования в организме хозяина попадают во внеклеточную среду. Присутствие в жидкостях организма бывает долгим (если говорить о внеклеточных патогенных бактериях) либо меньшим, когда организм поражен внутриклеточными микроорганизмами.
При обычной иммунной деятельности возбудители инфекций, токсические вещества, присутствующие за пределами клеток хозяина, подвергаются воздействию таких иммуноглобулинов:
- Эффекторная молекула — молекула небольшая, концентрация которой регулирует активность молекулы белка;
- В-лимфоциты способны продуцировать антитела в двух формах — мембраносвязанной и секретируемой (растворимой).
Почему снижается иммунитет
Снижение работы иммунной системы имеет конкретные предпосылки, которые указывают на проблемы со здоровьем. Их относительно делят на ряд групп:
Неправильный образ жизни:
- скудное питание;
- болезненное состояние, возникающее при недостаточном поступлении в организм витаминов по сравнению с их расходованием;
- состояние, характеризующееся низким содержанием гемоглобина или красных кровяных клеток в крови;
- переизбыток либо недостаток физических нагрузок;
- нарушений режим сна;
- употребление спиртного, курение;
- плохая экология;
- отравление организма выбросами.
Иммунитет может понижаться по причине заболеваний:
- патологии кровеносной системы;
- диарея из-за нарушенного всасывания (нарушение пищеварительно-транспортной функции тонкой кишки);
- быстрое и резкое снижение функции почек и печени;
- самоотравление организма азотистыми соединениями, такими как мочевина, мочевая кислота, креатинин и индикан;
- ВИЧ-инфекция;
- иммунодефициты врожденного и полученного характера;
- онкологические заболевания;
- длительное антибактериальное лечение;
- химиотерапия;
- гельминты.
Не нужно заниматься самолечением, так как повышение иммунитета - дело не из простых. В связи с этим нужен медицинский контроль.
Комплексное исследование гуморального иммунитета
Иммунограмма – список характеристик, которые расшифровывают по результатам анализа крови. Таким образом, можно узнать о работе иммунной системы. Однако с процедурой невозможно узнать фактор заболевания. Выяснить, есть ли иммунитет к какому-то конкретному заболеванию, тоже не выйдет.
У иммунной системы непростой механизм. Поэтому характеристики оцениваются не лишь по числу, однако, по их соответствию и динамике. Как правило, в иммунограмме указываются последующие характеристики:
- Численность лимфоцитов;
- Т-лимфоциты (распознают антиген и сообщают В- лимфоцитам);
- Т-хелперы (главной функцией которых является усиление адаптивного иммунного ответа);
- Естественные киллеры (большие гранулярные лимфоциты, являющиеся частью врожденного иммунитета);
- В-лимфоциты (получив информацию, выделяют антитела);
- Уровень иммуноглобулинов истребляющих патогенные микроорганизмы;
- Маркер гибели клеток.
Захваченные антителами чужеродные элементы, что в скором времени должны раствориться. Когда их накапливается очень большое количество, то это критерий аутоиммунных болезней. То есть организм не распознает свои клетки, формирует антитела для атаки (повышенный уровень сахара в крови, поражение миелиновой оболочки нервных волокон головного и спинного мозга., воспалительное заболевание соединительной ткани суставов).
6.3. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Основной функцией иммунной системы является контроль за постоянством внутренней среды организма и удаление болезнетворных микробов или чужеродных молекул. В выполнении этой функции важная роль принадлежит механизмам врожденного иммунитета. Их называют еще факторами неспецифической защиты, т.к. они защищают организм от различных экзогенных и эндогенных агрессий, а их защитные функции лишены избирательности. К системе врожденного иммунитета относятся фагоцитарные клетки крови и тканей, натуральные киллеры, а также молекулы, продуцируемые этими клетками (система комплемента, интерлейкины, интерфероны и др.).
Механизмы специфического иммунного ответа включаются только после контакта с антигеном, а защита выполняется высокоспециализированными клетками иммунной системы. Распознавание и элиминацию чужеродных агентов осуществляют лимфоциты (клеточный иммунитет), а также продуцируемые и секретируемые ими антитела - иммуноглобулины (гуморальный иммунитет). Все эти компоненты находятся в тесной взаимосвязи; местом их функциональной кооперации являются органы и ткани иммунной системы организма. В гематологической клинике обычно используются методы изучения гуморального и клеточного иммунитета, а также системы фагоцитов.
6.3.1. Изучение гуморального звена иммунитета.
Концентрации иммуноглобулинов классов M, G, A в сыворотке крови, а также секреторного иммуноглобулина А (SIgA) и S-компонентов в слюне и других секретах являются важнейшими параметрами гуморального звена иммунной системы. Методы количественной оценки иммуноглобулинов в биологических средах можно разделить на несколько групп в соответствии с принципами, лежащими в их основе: иммунопреципитация в геле, нефелометрия или турбодиметрия, твердофазный иммуноферментный анализ и радиоиммуноанализ. Они основаны на сравнении концентрации иммуноглобулинов в исследуемом объекте со стандартным раствором установленной концентрации.
В иммунологических исследованиях наибольшее распространение получил метод радиальной иммунодиффузии по Манчини. Он основан на том, что при встрече антигена (АГ) и антитела (АТ), относящегося к определенному классу иммуноглобулинов, в агаровом геле происходит их взаимодействие, и образующийся преципитат выпадает в осадок в виде визуально определяемых зон или полос. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации иммуноглобулина. В норме содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови составляет: IgG - 13,9±0,64 г/л, IgA - 2,82±0,19 г/л, IgM - 1,18±0,06 г/л.
Лазерная нефелометрия основана на регистрации светового потока, который рассеивается комплексом АГ-АТ, взвешенным в оптически прозрачной среде. Принцип турбодиметрии основан на регистрации света, поглощаемого образовавшимся комплексом АГ-АТ. Большим преимуществом кинетической нефелометрии является быстрота получения результатов (несколько минут; для сравнения: метод Манчини для IgG и IgA - 24 часа, для IgM - 48 часов).
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) в силу своей большой чувствительности применяется для определения в сыворотке минорных иммуноглобулинов IgD и IgE, а также для определения всех классов и субклассов иммуноглобулинов в супернатантах культур лимфоцитов периферической крови, стимулированных В-митогенами: бактериальным липополисахаридом (ЛПС), митогеном растительного происхождения PWM, антителами против иммуноглобулиновых m-цепей.
Недостаточность иммуноглобулинов может быть врожденной или приобретенной. Причинами недостаточности иммуноглобулинов могут быть: дефекты пролиферации, дифференцировки и функций В-лимфоцитов, нарушения регуляции синтеза иммуноглобулинов или переключения на другой изотип, связанные с дефектами Т-хелперов или соответствующих цитокинов, общая недостаточность белкового синтеза, ускорение катаболизма молекул иммуноглобулинов или их разрушение протеолитическими ферментами.
Примером генетического дефекта является агаммаглобулинемия Брутона, которая развивается вследствие мутации в гене, кодирующем тирозинкиназу, которая необходима для дифференцировки В-клеток. В результате предшественники В-лимфоцитов не могут дифференцироваться в зрелые В-лимфоциты. У таких больных отсутствуют зрелые В-лимфоциты, плазматические клетки и нет никаких иммуноглобулинов.
Злокачественная трансформация В-лимфоцитов приводит к селективной пролиферации какого-то одного клона клеток и к продукции антител одного класса и одной специфичности. Такие случаи относятся к моноклональным гаммапатиям и проявляются вариабельными иммунодефицитами. Примером вторичного иммунодефицита, развивающегося вследствие злокачественной трансформации В-лимфоцитов, является множественная миелома, при которой в сыворотке больного появляется большое количество гомогенного белка - моноклонального иммуноглобулина, секретируемого злокачественным клоном В-клеток. Избыток легких цепей иммуноглобулинов, продуцируемых теми же клетками, выводится через почки и выявляется в моче в виде белка Бенс-Джонса.
Нарушение синтеза иммуноглобулинов наблюдается при лимфогранулематозе, неходжкинских лимфомах, хроническом лимфолейкозе. Лечение онкогематологических заболеваний с помощью цитостатических препаратов, стероидов, рентгеновского облучения может вызвать существенное снижение уровня иммуноглобулинов.
6.3.2. Изучение клеточного звена иммунитета.
Для оценки клеточного иммунитета применяется набор иммунологических тестов, среди которых наибольшее распространение получили: 1)определение гиперчувствительности замедленного типа с помощью кожных проб; 2)изучение пролиферативной активности лимфоцитов;3) количественная оценка популяций и субпопуляций лимфоцитов;4)определение уровня секретируемых цитокинов; 5)реакция торможения миграции лейкоцитов.
6.3.2.1. Кожные тесты.
Кожные тесты являются аналогом туберкулиновых проб. Так как эти реакции опосредуются Т-лимфоцитами, то в качестве антигенов выбираются только Т-зависимые антигены, например, вирус свинки, очищенный туберкулин, кандидозный антиген, дифтерийный или столбнячный анатоксин, антиген трихофитона, гемоцианин.
Указанные антигены вводятся внутрикожно, и учет реакции осуществляется по величине воспалительного очага через 24-48 часов. Кожный тест является интегральной реакцией, оценивающей несколько этапов иммунного ответа (распознавание антигена, хемотаксис, синтез цитокинов). Главным недостатком при проведении этого теста является трудность стандартизации воспалительной реакции.
Результаты оценки клеточного иммунитета с помощью кожных проб являются достаточно постоянными как у мужчин, так и у женщин в возрасте от 16 до 65 лет. С возрастом клеточный иммунитет понижается, что проявляется снижением способности давать положительные реакции. Наблюдается корреляция между кожными пробами и повышенной заболеваемостью (инфекции, злокачественные опухоли) или смертностью в определенных группах больных. Поэтому кожные тесты можно рассматривать и как прогностические.
6.3.2.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.
Определение пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови является важнейшим показателем функциональной активности этих клеток. В качестве Т-клеточных митогенов используются фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (Кон А), В-клеточных - митоген лаконоса (МЛ), а также аллогенные клетки. В качестве специфических антигенов применяются чаще всего РРD, кандидозные антигены, стрептокиназа-стрептодорназа, дифтерийный и столбнячный анатоксины.
Некоторые Т-митогены реагируют с различными субпопуляциями Т-клеток: Кон А преимущественно активирует Т-супрессоры, ФГА - Т-хелперы синтеза иммуноглобулинов. При оценке результатов пролиферативного ответа на митогены следует учитывать, что эти агенты являются поликлональными стимуляторами, и положительный результат говорит о том, что регулирующие клетки в организме существуют и могут давать ответ на соответствующий стимул.
В настоящее время для оценки пролиферативного ответа на Т-митогены или аллоантигены используется только радиометрический метод с применением 3 H- и 14 С-меченного тимидина. Стимулированные лимфоциты инкубируются с изотопом в течение 6-24 часов с последующим осаждением клеток на специальных фильтрах и учетом реакции бластной трансформации с помощью жидкостных сцинтилляционных b-cчетчиков.
Эта реакция может быть ослаблена Т-клеточных дефицитах (атаксия-телеангиэктазия, генетически детерминированная аплазия тимуса - синдром Ди-Джорджи), онкогематологических заболеваниях, особенно в терминальной стадии, вторичных иммунодефицитах.
6.3.2.3. Количественная оценка популяций и субпопуляций лимфоцитов.
Изучение субпопуляций Т-клеток ранее проводилось с помощью реакции Е-розеткообразования, основанной на том, что одним из маркеров Т-лимфоцитов является поверхностный гликопротеин - Е-рецептор (в настоящее время обозначается как CD2), способный взаимодействовать с мембранной структурой эритроцитов барана (Е-розеткообразование) и с адгезионной молекулой LFA-3 на эритроцитах человека - ауто-розеткообразование (ауто-РОК). Этот маркер появляется на мембране предшественников Т-лимфоцитов в тимусе и сохраняется на зрелых Т-лимфоцитах в периферической циркуляции. Кластер CD2 обнаруживается на поверхности естественных киллеров (ЕК), лимфокинактивированных киллеров (LAK), имеющих морфологию больших гранулярных лимфоцитов, а также клеток нелимфоидного ряда. Таким образом, реакция Е-розеткообразования является показателем суммы перечисленных клеток, несущих антиген CD2. В связи с этим не рекомендуется использовать Е-розеткообразование для идентификации Т-клеток.
Для оценки субпопуляций Т-лимфоцитов ранее использовался также теофиллиновый тест, который в настоящее время в связи с низкой специфичностью не применяется.
Развитие современной техники оценки различных субпопуляций лимфоцитов связано с: 1)разработкой и стандартизацией панели моноклональных антител (МАТ) к различным поверхностным дифференцировочным антигенам клеток; 2)появлением нового поколения проточно-цитометрического оборудования; 3)совершенствованием компьютеризированных методов обработки данных.
В настоящее время с помощью МАТ идентифицировано более 165 поверхностных антигенов лейкоцитов, определена их молекулярная масса, химическая структура, функция. Дифференцировочные лейкоцитарные антигены обозначаются как "CD" (кластер дифференцировки) и имеют номера, соответствующие хронологии их открытия. Выявляя поверхностные дифференцировочные маркеры, можно определить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференцировки и активации, функциональную активность и взаимодействие с другими клетками.
Наиболее значимыми поверхностными маркерами являются: для определения зрелых Т-лимфоцитов - CD3, Т-хелперов/индукторов - CD4, Т-цитотоксических/супрессоров - CD8, естественных киллеров (NK) - СD16, CD56 и СD57, маркеров ранней активации - CD25, CD71, HLA-DR. Определение поверхностных иммуноглобулинов продолжает оставаться одним из главных методов идентификации В-лимфоцитов. Надежным методом их определения является также выявление CD19, CD20 и CD22 с помощью МАТ.
Лучшим методом выявления поверхностных маркеров является проточная цитометрия, сущность которой заключается в определении гетерогенности популяций клеток по экспрессируемым маркерам клеточной поверхности. В гематологической клинике основными задачами проточной цитометрии являются: 1)иммунофенотипирование лейкозов и лимфом; 2)анализ распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия); 3)иммунофенотипирование лимфоцитов, оценка внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями; 4)анализ процессов активации и пролиферации клеток иммунной системы; 5)выявление и мониторинг минимальной остаточной болезни.
Иммунофенотипирование острых лейкозов.
Иммунофенотипирование острых лейкозов с помощью проточной цитометрии проводится в два этапа: сначала определяется разновидность лейкоза (В- или Т-острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз), затем подварианты заболевания (В 1 -В 5 -варианты В-клеточного, Т 1 -Т 4 -варианты Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, М0-М7 варианты острого миелоидного лейкоза) - таблицы 6.3.1-6.3.4.
Таблица 6.3.1.
Панель маркеров для проведения первого этапа иммунофенотипирования.
Таблица 6.3.2.
Иммунологическая классификация В-линейных острых лимфобластных лейкозов.
Дифференцировочные антигены |
|||||||||
Пре-пре-В-ОЛЛ | |||||||||
О-ОЛЛ (ОЛЛ “общего типа”) | |||||||||
Пре-В-ОЛЛ В3 | |||||||||
Переходный пре-В-ОЛЛ | |||||||||
Зрелый В-ОЛЛ |
Обозначения: cy - цитоплазматическая экспрессия антигена; s - поверхностная экспрессия антигена; +/- большинство позитивных случаев; + позитивный; - негативный.
Таблица 6.3.3.
Иммунологическая классификация T-линейных острых лимфобластных лейкозов.
Подвариант лейкозa |
Дифференцировочные антигены |
||||||
Про-Т-ОЛЛ Т1 | |||||||
Пре-Т-ОЛЛ Т2 | |||||||
Кортикальный-T-ОЛЛ Т3 | |||||||
Зрелый-Т-ОЛЛ Т4 |
Обозначения: cy - цитоплазматическая экспрессия; s - поверхностный;
+/- - большинство позитивных случаев; -/+ - большинство негативных случаев; + - позитивный; - негативный.
Таблица 6.3.4.
Цитохимические, цитогенетические и иммунофенотипические свойства острых миелоидных лейкозов
Дифференцировочные антигены |
Цитогенетические |
|||||||||||||||
нарушения |
||||||||||||||||
Миелобластный без созревания | ||||||||||||||||
Миелобластный без дифференцировки |
8;t(9;22);inv(3) |
|||||||||||||||
Миелобластный с дифференцировкой | ||||||||||||||||
Промиелоцитарный | ||||||||||||||||
Миеломоноцитарный | ||||||||||||||||
Миеломоноцитарный с эозинофилией в костном мозге |
inv(16);t(16;16) |
|||||||||||||||
Моноцитарный |
t(9;11);+8;t(10;11) 11q23 нарушения |
|||||||||||||||
Эритролейкемия |
комплекс реаранжировок; del (5q);+8 |
|||||||||||||||
Мегакариоцитарный |
комплекс реаранжировок с вовлечением -5 или del(5q); +8 |
Сокращения: Glyc.A - гликофорин; MП - миепероксидаза; СЭ - специфическая эстераза; НСЭ - неспецифическая эстераза.
Определение уровня секретируемых цитокинов
Главным методическим подходом для определения способности Т-лимфоцитов и других клеток продуцировать цитокины является их активация различными стимуляторами: например, Т-клеток - Т-митогенами (ФГА, Кон А), макрофагов - липополисахаридом энтеробактерий с идентификацией в супернатантах соответствующих цитокинов. Для этих целей могут использоваться биологические (применение чувствительной к данному цитокину линии клеток), иммуноферментные и радиоиммунные методы. Наиболее перспективными являются иммуноферментные методы, основанные на применении моноклональных антител к двум различным эпитопам цитокина.
Реакция торможения миграции лейкоцитов
Реация торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) основана на способности Т-лимфоцитов, специфичных к данному антигену, при взаимодействии с ним синтезировать совокупность цитокинов, активирующих фагоцитарные клетки. Одним из проявлений этого процесса является ингибиция миграционных свойств лейкоцитов. Данное свойство играет важную роль в защите организма от чужеродных агентов, так как способствует накоплению фагоцитарных клеток в воспалительном очаге. Определение фактора, ингибицирующего миграцию (MIF), оказалось ценным тестом для оценки функциональной активности Т-лимфоцитови и специфической сенсибилизации. В связи с развитием учения о цитокинах стало ясно, что именно они осуществляют активацию и ингибицию движения фагоцитарных клеток, причем главным действующим фактором в этой активации является g-интерферон. РТМЛ можно использовать для оценки как интенсивности хемотаксиса (миграционной способности) лейкоцитов при различных заболеваниях иммунной системы, так и для выявления клеточного иммунитета к различным антигенам и аутоантигенам.
Исследование функции фагоцитирующих клеток.
Процесс фагоцитоза состоит из ряда последовательных и взаимосвязанных стадий. К ним относятся подвижность, хемотаксис, адгезия, поглощение, дегрануляция, образование активных форм кислорода и азота, киллинг и расщепление объекта фагоцитоза.
Определение хемотаксиса лейкоцитов проводят методом миграции в микрофильтрационных камерах или в агарозном геле под влиянием различных хемотаксических факторов (хемоаттрактантов), к которым относятся некоторые N-формилпептиды бактериального просхождения, компоненты комплемента (С3a и С5a), лейкотриены, тромбоцитактивирующий фактор, ИЛ-8 и т.д. Все эти вещества могут накапливаться в воспалительном очаге и оказывать влияние на движение фагоцитов.
Изучение синтеза и экспрессии адгезионных молекул.
За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают их поверхностные рецепторы, называемые селектинами и интегринами. С помощью селектинов фагоциты “катаются” по поверхности эндотелиальных клеток перед их твердым прикреплением с помощью интегринов к этой поверхности.
2. Методы оценки состояния гуморального и клеточного иммунитета. Оценка иммуного статуса организма.
Клиническая иммунология - это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммунопрепараты играют ведущую роль.
Иммунный статус - это структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей.
Таким образом, иммунный статус характеризует анатомо-функциональное состояние иммунной системы, т. е. ее способность к иммунному ответу на определенный антиген в данный момент времени.
На иммунный статус оказывают влияние следующие факторы:
Климато-географические; социальные; экологические (физические, химические и биологические); «медицинские» (влияние лекарственных веществ, оперативные вмешательства, стресс и т. д.).
Среди климато-географических факторов на иммунный статус оказывают влияние температура, влажность, солнечная радиация, длина светового дня и др. Например, фагоцитарная реакция и кожные аллергические пробы менее выражены у жителей северных регионов, чем у южан. Вирус Эпштейна-Барр у людей белой расы вызывает инфекционное заболевание - мононуклеоз, у лиц негроидной расы - онкопатологию (лимфома Беркитта), а у лиц желтой расы - совсем другую онкопатологию (назофарингеальная карцинома), причем только у мужчин. Жители Африки менее подвержены заболеванию дифтерией, чем европейское население.
К социальным факторам, оказывающим влияние на иммунный статус, относятся питание, жилищно-бытовые условия, профессиональные вредности и т. п. Важное значение имеет сбалансированное и рациональное питание, поскольку с пищей в организм поступают вещества, необходимые для синтеза иммуноглобулинов, для построения иммунекомпетентных клеток и их функционирования. Особенно важно, чтобы в рационе присутствовали незаменимые аминокислоты и витамины, особенно А и С.
Значительное влияние на иммунный статус организма оказывают жилищно-бытовые условия. Проживание в плохих жилищных условиях ведет к снижению общей физиологической реактивности, соответственно иммунореактивности, что нередко сопровождается повышением уровня инфекционной заболеваемости.
Большое влияние на иммунный статус оказывают профессиональные вредности, поскольку человек проводит на работе значительную часть своей жизни. К производственным факторам, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие на организм и снижать иммунореактивность, относят ионизирующую радиацию, химические вещества, микробы и продукты их жизнедеятельности, температуру, шум, вибрацию и т. д. Источники радиации получили в настоящее время очень широкое распространение в различных отраслях промышленности (энергетика, горнохимическая, аэрокосмическая и др.).
Неблагоприятное влияние на иммунный статус оказывают соли тяжелых металлов, ароматические, алкилирующие соединения и другие химические вещества, в том числе моющие средства, дезинфектанты, пестициды, ядохимикаты, широко применяемые в практике. Таким профессиональным вредностям подвержены работники химических, нефтехимических, металлургических производств и др.
Неблагоприятное влияние на иммунный статус организма оказывают микробы и продукты их жизнедеятельности (чаще всего белки и их комплексы) у работников биотехнологических производств, связанных с производством антибиотиков, вакцин, ферментов, гормонов, кормового белка и др.
Такие факторы, как низкая или высокая температура, шум, вибрация, недостаточная освещенность, могут снижать иммунореактивность, оказывая опосредованное действие на иммунную систему через нервную и эндокринную системы, которые находятся в тесной взаимосвязи с иммунной системой.
Глобальное действие на иммунный статус человека оказывают экологические факторы, в первую очередь, загрязнение окружающей среды радиоактивными веществами (отработанным топливом из ядерных реакторов, утечка радионуклидов из реакторов при авариях), широкое применение пестицидов в сельском хозяйстве, выбросами химических предприятий и автотранспорта, биотехнологических производств.
На иммунный статус оказывают влияние различные диагностические и лечебные медицинские манипуляции, лекарственная терапия, стресс. Необоснованное и частое применение рентгенографии, радиоизотопного сканирования может влиять на иммунную систему. Иммунореактивность изменяется после травм и хирургических операций. Многие лекарственные препараты, в том числе антибиотики, способны оказывать побочное иммунодепрессивное действие, особенно при длительном приеме. Стресс приводит к нарушениям в работе Т-системы иммунитета, действуя, в первую очередь, через ЦНС.
Несмотря на вариабельность иммунологических показателей в норме, иммунный статус можно определить путем постановки комплекса лабораторных тестов, включающих оценку состояния факторов неспецифической резистентности, гуморального (В-система) и клеточного (Т-система) иммунитета.
Оценка иммунного статуса проводится в клинике при трансплантации органов и тканей, аутоиммунных заболеваниях, аллергиях, для выявления иммунологической недостаточности при различных инфекционных и соматических заболеваниях, для контроля эффективности лечения болезней, связанных с нарушениями иммунной системы. В зависимости от возможностей лаборатории оценка иммунного статуса чаше всего базируется на определении комплекса следующих показателей:
1) общего клинического обследования;
2) состояния факторов естественной резистентности;
3) гуморального иммунитета;
4) клеточного иммунитета;
5) дополнительных тестов.
При общем клиническом обследовании учитывают жалобы пациента, анамнез, клинические симптомы, результаты общего анализа крови (включая абсолютное число лимфоцитов), данные биохимического исследования.
Гуморальный иммунитет определяют по уровню иммуноглобулинов классов G, M, A, D, Е в сыворотке крови, количеству специфических антител, катаболизму иммуноглобулинов, гиперчувствительности немедленного типа, показателю В-лимфоцитов в периферической крови, бласттрансформации В-лимфоцитов под действием В-клеточных митогенов и другим тестам.
Состояние клеточного иммунитета оценивают по количеству Т-лимфоцитов, а также субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови, бласттрансформации Т-лимфоцитов под действием Т-клеточных митогенов, определению гормонов тимуса, уровню секретируемых цитокинов, а также постановкой кожных проб с аллергенами, контактной сенсибилизацией динитрохлорбензолом. Для постановки кожных аллергических проб используются антигены, к которым в норме должна быть сенсибилизация, например проба Манту с туберкулином. Способность организма к индукции первичного иммунного ответа может дать контактная сенсибилизация динитрохлорбензолом.
В качестве дополнительных тестов для оценки иммунного статуса можно использовать такие тесты, как определение бактерицидное™ сыворотки крови, титрование СЗ-, С4-компонентов комплемента, определение содержания С-реактивного белка в сыворотке крови, определение ревматоидных факторов и других аутоантител.
Таким образом, оценка иммунного статуса проводится на основании постановки большого числа лабораторных тестов, позволяющих оценить состояние как гуморального и клеточного звеньев иммунной системы, так и факторов неспецифической резистентности. Все тесты разделены на две группы: тесты 1-го и 2-го уровня. Тесты 1-го уровня могут быть выполнены в любой клинической иммунологической лаборатории первичного звена здравоохранения, они используются для первичного выявления лиц с явно выраженной иммунопатологией. Для более точной диагностики используются тесты 2-го уровня.
Определение числа B-лимфоцитов Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20. У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10-20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.
Определение титра антител При подозрении на недостаточность гуморального иммунитета оценивают титр антител к белковым и полисахаридным антигенам. Обычно их определяют после вакцинации или инфекции.
Антитела к белковым антигенам В большинстве случаев исследуют IgG к дифтерийному и столбнячному анатоксинам до и спустя 2-4 нед после вакцинации АКДС или АДС. Поскольку почти все взрослые вакцинированы АКДС, уровень антител после ревакцинации служит показателем вторичного иммунного ответа. Можно определить также антитела к антигену PRP после введения вакцины против Haemophilus influenzae типа B. Хотя этот антиген представляет собой полисахарид, в конъюгированной вакцине он действует как белковый антиген. Иногда исследуют антитела после иммунизации инактивированной вакциной против полиомиелита и рекомбинантной вакциной против гепатита B. При подозрении на иммунодефицит живые вирусные вакцины противопоказаны.
Антитела к полисахаридным антигенам Для оценки гуморального иммунного ответа на полисахаридные антигены применяются пневмококковая и менингококковая вакцины, не содержащие белковых носителей. Титр антител определяют до и спустя 3-4 нед после вакцинации. В некоторых исследовательских лабораториях для этих целей используют неконъюгированную вакцину против Haemophilus influenzae типа B. Результаты оценивают с учетом возраста больного. Так, у детей младше 2 лет иммунный ответ на полисахаридные антигены слабый, у некоторых детей он остается таковым вплоть до 5 лет. В связи с этим применение полисахаридных вакцин у детей младшего возраста нецелесообразно и даже противопоказано, поскольку может привести к иммунологической толерантности и неэффективности ревакцинации в более старшем возрасте.
Оценка первичного и вторичного гуморального иммунного ответа Для определения клиренса антигена, уровня IgM (при первичном иммунном ответе) и IgG (при вторичном иммунном ответе) в качестве белкового антигена используют бактериофаг фихи 174 - бактериальный вирус, безопасный для человека. Для оценки первичного гуморального иммунного ответа применяют также гемоцианин брюхоногих моллюсков, рекомбинантную вакцину против гепатита B, мономерный флагеллин, вакцину против клещевого энцефалита.
Естественные антитела (изогемагглютинины, антитела к стрептолизину O, гетерофильные антитела, например антитела к эритроцитам барана) в норме присутствуют в сыворотке почти всех людей. Это объясняется тем, что антигены, против которых направлены эти антитела, широко распространены и содержатся в пищевых продуктах, вдыхаемых частицах, микрофлоре дыхательных путей.
Определение подклассов IgG. Если при рецидивирующих бактериальных инфекциях дыхательных путей общий уровень IgG в норме или незначительно снижен или выявляется изолированный дефицит IgA, показано определение подклассов IgG. При этом можно обнаружить дефицит IgG 2 (IgG 2 составляет около 20% IgG), который может быть изолированным или сочетаться с дефицитом IgA или IgG 4 . Следует помнить, что функциональная оценка гуморального иммунного ответа - более информативный метод исследования, чем количественное определение подклассов IgG. Так, при нормальном уровне IgG 2 часто бывает снижен уровень антител к полисахаридным антигенам Streptococcus pneumoniae. Наряду с этим возможен врожденный дефицит IgG 2 , обусловленный нарушением синтеза тяжелых цепей, в отсутствие каких-либо клинических проявлений иммунодефицита.
Определение IgA. Изолированный дефицит секреторного IgA при нормальном уровне IgA в сыворотке встречается редко. Как правило, наблюдается одновременный дефицит секреторного и сывороточного IgA. Изолированный дефицит IgA клинически не проявляется или сопровождается легкими инфекциями верхних дыхательных путей. Это обусловлено тем, что при дефиците IgA компенсаторно повышается уровень IgG в сыворотке и IgM в секрете слизистых. Уровень IgA измеряют в слезе, слюне и других биологических жидкостях. Существует два подкласса IgA - IgA 1 и IgA 2 . В крови и секрете дыхательных путей преобладает IgA 1 , в секретах ЖКТ - IgA 2 . Нормальные показатели уровней IgA 1 и IgA 2 .
Синтез иммуноглобулинов in vitro. Это исследование позволяет оценить выработку IgM, IgG и IgA стимулированными B-лимфоцитами. Смешивая обработанные разными стимуляторами T- и B-лимфоциты здоровых и больных, можно оценить функцию T-хелперов и B-лимфоцитов. В большинстве случаев дефицит антител обусловлен нарушением дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки.
Биопсию лимфоузлов при подозрении на первичный иммунодефицит, как правило, не производят. Она показана лишь в тех случаях, когда диагноз неясен и у больного увеличены лимфоузлы, что требует исключения гемобластоза. Биопсию обычно производят через 5-7 сут после антигенной стимуляции. Антиген вводят в область, лимфа от которой оттекает в группу лимфоузлов, один из которых подлежит биопсии. При недостаточности гуморального иммунитета в лимфоузле снижено число плазматических клеток, количество первичных фолликулов увеличено, вторичные фолликулы отсутствуют, толщина коркового вещества уменьшена, наблюдается перестройка ткани лимфоузла, иногда увеличивается число макрофагов и дендритных клеток.
Биопсию кишечника производят при общей вариабельной гипогаммаглобулинемии и изолированном дефиците IgA. Биопсия тонкой кишки показана при хронической диарее и синдроме нарушенного всасывания для исключения атрофии ворсинок слизистой и инфекций, вызванных Cryptosporidium spp. и Giardia lamblia.
Скорость выведения антител изучают с помощью меченых иммуноглобулинов. Это исследование показано при подозрении на потерю иммуноглобулинов через ЖКТ.