Treponema pallidum: характеристика, в анализе крови, лечение. Бледная трепонема – возбудитель сифилиса Treponema pallidum микробиология
Для подтверждения диагноза «сифилис» необходимо ориентироваться не только на клинические данные – объективные симптомы болезни – наличие характерного шанкра в первичном периоде, пятнистых высыпаний во вторичном или гуммозной и бугорковой сыпи при позднем сифилисе. С этой целью используются методы лабораторной диагностики сифилиса, наиболее часто применяемые из которых – микроскопия, культуральное исследование материала от пациента, серологические пробы и гистологическое исследование образцов биологических тканей. В данной статье будет рассмотрена микроскопическая диагностика сифилиса.
Микроорганизмы – спирохеты – в организме больного человека находятся в межтканевом пространстве, между соединительнотканными волокнами, окружают русла лимфатических и кровеносных сосудов. Чтобы точно определить наличие возбудителя сифилиса, необходимо забрать материал для исследования именно оттуда. Конечно, забирать материал имеет смысл только элементов сыпи (в особенности с эрозий и язвочек), с поверхности шанкров и со слизистых оболочек гениталий, ротовой полости и прямой кишки. Кроме того, существуют и альтернативные способы, например, пункция лимфатических узлов.
Как правильно забрать материал для исследования?
Чтобы мазок на сифилис получился удачным, перед взятием диагностического материала с поверхности язвы или эрозии нужно убрать все лишние загрязнения с помощью марлевого тампона, пропитанного физиологическим раствором. После подсушивания поверхности элемента на его поверхность начинает просачиваться жидкость, в большом количестве содержащая возбудителя болезни. Ускорить процесс можно с помощью мягкого надавливания на элемент (разумеется, в резиновых перчатках). После этого с помощью предметного стекла изготовляется мазок на сифилис, который после обработки микроскопируется. Чтобы получить материал из неподверженных эрозии высыпаний, используется метод поскабливания их скальпелем или стерильной бритвой.
Темнопольная микроскопия
Одним из наиболее перспективных и дешевых методов диагностики сифилиса является микроскопия трепонем в темном поле. При этом препарат не высушивается, исследование проводят в капле обычного изотонического раствора соли. На предметное стекло направляют узким пучком яркий свет (его получают с помощью специального прибора – конденсатора). Свет при этом падает на препарат практически сбоку, в объективе при этом видно темное поле. Однако микробные тела, находящиеся в препарате, преломляют и отражают свет – в результате возникает крайне интересный оптический эффект (основанный на феномене Тиндаля) – трепонемы начинают выглядеть как светящиеся подвижные спирали с несколькими завитками.
Исследование по методу Романовскому – Гимзе
Данный способ (в отличие от окраски по Граму) позволяет получить хорошо различимое изображение микробного тела при микроскопии – это один из наиболее достоверных методов диагностики сифилиса. Исследование проводится следующим образом: полученный мазок на сифилис фиксируют в реактиве Никифорова (смесь равных долей этилового спирта и эфира), затем окрашивают с помощью пигмента Романовского – Гимзе в течение 2-5 часов. После прокрашивания мазка его сушат при температуре 25-28 градусов и исследуют под микроскопом в иммерсионной среде (специальном иммерсионном масле, практически не преломляющем лучи света). В результате окраски по Романовскому – Гимзе возбудитель сифилиса приобретает розовый оттенок цвета, в то время как остальные спирохеты окрашиваются в синие и фиолетовые тона.
Способ Морозова (импрегнация трепонем серебром)
Пожалуй, один из наиболее быстрых методов микроскопической диагностики сифилиса. Для своего осуществления требует нескольких реактивов:
- первый – уксусная кислота (охлажденная), формалин 40% и 100 мл стерильной воды;
- второй – танин, сто мл карболовой кислоты и столько же дистиллированной воды;
- третий – сто мл раствора нитрата серебра в воде.
Импрегнацию трепонем серебром (серебрение по Морозову) проводят следующим образом: мазок высушивают, заливают первым реактивом на одну минуту, после чего предметное стекло промывают водой. Затем наступает очередь второго реактива – стекло при этом нагревают на 1 минуту в пламени спиртовки (умеренно). После промывания стекло вновь нагревают до окраски мазка в коричневый цвет. Затем снова следует тщательное отмывание, сушка и исследование в иммерсионной среде. Бледные трепонемы после серебрения по Морозову выглядят черными или темно-коричневыми неподвижными микробными телами. Все морфологические свойства их сохраняются в достаточной степени для достоверной идентификации.
Сифилис — хроническое венерическое заболевание, характеризующееся последовательной сменой отдельных периодов болезни. Возбудитель сифилиса был. открыт в 1905 г. немецким ученым Шаудином.
Морфология и биологические свойства. Treponema pallidum представляет собой тонкую извитую нить размером 15x0,25—0,5 мкм, имеющую 8—14 равномерных витков спирали, расположенных близко друг к другу. С трудом окрашивается анилиновыми красками и поэтому получила название бледной спирохеты. Для окраски используют метод Романовского — Гимзы (спирохеты окрашиваются в бледно-розовый цвет), негативное окрашивание раствором туши (спирохеты остаются неокрашенными и видны на темном фоне). Для выявления спирохет в инфицированных тканях используют метод импрегнации серебром (метод Левадити), при котором трепонемы, окрашенные в черный цвет, видны на фоне желтых клеток ткани. При исследовании материала в темном поле зрения бледная спирохета отличается от сапрофитных спирохет, встречающихся на слизистых оболочках полости рта и половых органов, равномерными завитками, плавными волнообразными движениями.
Она тоньше других трепонем, способна сгибаться под углом и совершать характерные маятникообразные движения. Культивируется возбудитель сифилиса с трудом, в анаэробных условиях. Для выращивания используют среды, содержащие кроличью или лошадиную сыворотку (среды Уленгута и Терских). При этом культуральные (полученные на питательных средах) штаммы спирохет теряют вирулентность и изменяют антигенную структуру. Трепонемы содержат эндотоксин, имеют сложное антигенное строение.
Устойчивость. Бледная спирохета вне тканей больного быстро погибает, неустойчива при высушивании, действии обычных дезинфицирующих веществ и высокой температуры; даже при 40°С погибает через 2 ч. К низким температурам более устойчива: выдерживает замораживание до года.
Патогенность. В естественных условиях животные сифилисом не болеют. Экспериментально удается заразить обезьян, кроликов, хомяков.
Патогенез и клиника. Входными воротами инфекции являются слизистые оболочки и кожа, имеющие самые незначительные повреждения. Инкубационный период продолжается в среднем 3—4 нед, после чего наступает первичный период сифилиса: на месте внедрения возбудителя появляется небольшая эрозия, приподнятая над кожей, с ровными краями, гладким блестящим дном, розового или красного цвета, часто безболезненная, с плотным инфильтратом у основания, из-за которого она и получила название «твердый шанкр». Возникают недомогание, головная боль. Лимфатические узлы увеличиваются, становятся плотными без видимых признаков воспаления. Они, как правило, не спаяны с окружающими тканями. Через 20—30 дней твердый шанкр заживает.
Спирохеты из лимфатических узлов проникают в кровь, размножаются и заносятся в органы и ткани и могут вызвать их поражения. Через 6—7 нед от начала заболевания развивается вторичный период сифилиса, характеризующийся генерализацией процесса и появлением обильных и разнообразных высыпаний на коже и слизистых оболочках (сифилиды) розовых или красных тонов, Сифилиды могут возникать в виде розеол, папул, везикул, пустул. Если лечение не проводится, то через 2— 3 года наступает третий период сифилиса — гуммозный. Возникает бугорковый сифилид, или глубокий узловой сифилид (подкожная гумма). На коже и слизистых оболочках появляются плотные шаровидные бугорки. Они могут существовать неопределенно долгое время, а затем рассасываются или изъязвляются с последующим образованием рубца. При образовании сифилитической гуммы в подкожной жировой клетчатке появляется узел, который увеличивается, спаивается с окружающей клетчаткой и с кожей. Над центральной частью гуммы кожа истончается и она вскрывается. Гумма превращается в гуммозную язву с неприятным запахом: дно ее покрыто некротическим распадом. В течение нескольких месяцев язва заживает и на ее месте остается втянутый звездчатый рубец. В последнем, четвертом, парасифилитическом периоде, который может наступить через 10—20 лет после начала заболевания, наблюдаются специфические поражения центральной нервной системы в форме прогрессивного паралича или спинной сухотки.
Иммунитет. Естественный, врожденный, иммунитет отсутствует: заражение всегда приводит к развитию заболевания. Вопрос о состоянии приобретенного иммунитета до конца не изучен. Во время болезни вырабатывается не¬стерильный иммунитет, носящий характер клеточного, тканевого. Его называют противошанкерным, так как при повторном заражении во время болезни новый шанкр не появляется, а спирохеты распространяются по всему организму, принимая участие в развитии последующих сифилитических поражений.
Микробиологическая диагностика. Основные методы лабораторной диагностики — микроскопический и серо-логический. В первый период проводят микроскопию серозного содержимого твердого шанкра в темном поле или в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Микроскопическому исследованию подвергают также отделяемое кожных поражений вторичного и третичного периодов. Начиная с 5—6-й недели от момента заражения или на 2—3-й неделе после появления твердого шанкра используют серологические методы диагностики. Применяют РСК (реакцию Вассермана) и осадочные реакции (реакции преципитации) Кана и Закса — Витебского. Реакцию Вассермана ставят с сывороткой больного, используя неспецифические антигены (спиртовой экстракт липоидов из бычьего сердца с добавлением холестерина, или кардиолипиновый антиген), так как оказалось, что глобулины сыворотки больного сифилисом способны соединяться липоидными вытяжками, полученными из различных органов. Наряду с неспедифическими используют специфический антиген, полученный из ткани яичка кролика, зараженного бледной трепонемой. При отсутствии гемолиза реакцию считают положительной, так как очевидно, что комплемент связался со специфической системой антиген — антитело. Осадочные реакции просты по технике постановки. Суть их заключается в том, что при добавлении к сыворотке больного концентрированного липоидного антигена появляются помутнение, а затем и осадок. Ввиду того что антигены в этих реакциях неспецифичны, они могут быть положительны и при других инфекционных заболеваниях (туберкулез, малярия и др.).
Наиболее специфичной в серологической диагностике сифилиса является реакция иммобилизации трепонем (РИТ). Эта реакция основана на том, что при добавлении сыворотки больного сифилисом к тканевой культуре трепонем (культивируемых в яичнике кролика) они в присутствии комплемента теряют подвижность. Наряду с этой реакцией используется также непрямая РИф. Основными компонентами для постановки этой реакции являются: сыворотка больного (разведенная 1:200), тканевый штамм бледной спирохеты, антивидовая флюоресцирующая сыворотка против глобулинов человека.
Единственным источником инфекции является человек во все периоды болезни. Путь передачи — непосредственный контакт с больным (чаще всего при половом сношении), реже—через предметы обихода. Возможна передача инфекции новорожденному через плаценту от больной матери.
Профилактика и лечение. В СССР перед врачами поставлена задача ликвидации сифилиса. Для этого имеются все предпосылки: непрерывный рост благосостояния и культурного уровня жизни трудящихся, а также такие меры борьбы, как привлечение к обследованию и лечению лиц, являющихся источником заражения, и контактировавших с ними, массовые профилактические осмотры, диспансерные методы работы. Существенную роль в профилактике играют раннее выявление источников инфекции, своевременное лечение, ликвидация беспорядочных половых связей. Специфическая профилактика не проводится.
Для лечения применяют новарсенол, препараты висмута, ртути, пенициллин.
Treponema pallidum - возбудитель сифилиса включен в род Treponema (от лат. trepo - поворачивать, nemo - нить).
Т. pallidum открыта Ф. Шаудином в 1905 г. Большой вклад в изучение сифилиса внесли И. И. Мечников, П. Эрлих, Д. К. Заболотный и др.
Морфология . Т. pallidum - спиралевидная нить размером 8-18 × 0,08-0,2 мкм с мелкими, равномерными завитками. Число завитков 12-14. Концы трепонемы заострены или закруглены. Трепонемы подвижны. Обладают четырьмя видами движения. По Романовскому - Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет, поэтому они называются Т. pallidum - бледная трепонема. Плохое окрашивание объясняется малым содержанием нуклеопротеидов. Спирохеты можно выявлять в препаратах, окрашенных по Бурри, серебрением. Кроме того, их изучают в живом состоянии - в темном поле.
Возбудители сифилиса спор и капсул не имеют (см. рис. 4).
Культивирование . Бледные трепонемы очень требовательны к питательным средам. На искусственных питательных средах они растут только в присутствии кусочков мозга или почек кролика и асцитической жидкости. Растут медленно, 5-12 дней при температуре 35-36° С в анаэробных условиях. Бледные трепонемы хорошо размножаются в курином эмбрионе (поперечным делением). При выращивании на искусственных питательных средах трепонемы теряют вирулентность. Такие культуры называются культуральными. Культуры, выращенные в курином эмбрионе, называют тканевыми. Они обычно сохраняют вирулентность.
Ферментативными свойствами трепонемы не обладают. Однако культуральные штаммы различаются между собой по способности образовывать индол и сероводород.
Токсинообразование . Не установлено.
Антигенная структура . Бледная трепонема содержит несколько антигенных комплексов: полисахаридный, липидный и протеиновый. Серогруппы и серовары не установлены.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Бледные трепонемы малоустойчивы. Температура 45-55° С губит их через 15 мин. К низким температурам они устойчивы. При замораживании сохраняются до года. Спирохеты чувствительны к солям тяжелых металлов (ртути, висмута, мышьяка и др.). Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их в течение нескольких минут. Они чувствительны к бензилпенициллину, бициллину и др. Под влиянием некоторых факторов внешней среды и антибактериальных препаратов трепонемы могут образовывать цисты. В такой форме они длительно находятся в организме в латентном состоянии.
Восприимчивость животных . В естественных условиях животные сифилисом не болеют. Однако на обезьянах, как показали И. И. Мечников и Э. Ру, можно воспроизвести клиническую картину сифилиса: на месте введения образуется твердый шанкр. В настоящее время показано, что при заражении кроликов, морских свинок на месте введения или в другом месте на коже образуются язвы. На кроликах путем пассажей можно длительное время сохранять выделенный штамм трепонем.
Источники инфекции . Больной человек.
Пути передачи . Контакт бытовой (прямой контакт), преимущественно половой путь. Иногда сифилис может передаваться через предметы (посуду, белье). От больной сифилисом матери заболевание передается через плаценту ребенку (врожденный сифилис).
Патогенез . Входными воротами являются слизистые оболочки половых путей и ротовой полости.
Первичный период - спирохеты попадают на слизистую оболочку, и после инкубационного периода (в среднем 3 нед) на месте внедрения образуется язва, которая характеризуется плотными краями и дном - твердый шанкр. Образованию твердого шанкра сопутствует увеличение лимфатических узлов. Первичный период продолжается 6-7 нед.
Вторичный период - возбудители сифилиса по лимфатическим и кровеносным путям распространяются по всему организму. При этом на коже и слизистых оболочках образуются розеолы, папулы, везикулы. Продолжительность этого периода - 3-4 года.
Третий период - развивается при нелеченом сифилисе. В этот период в органах, тканях, костях, сосудах образуются грануляционные разрастания - гуммы или гуммозные инфильтраты, склонные к распаду. Этот период может продолжаться несколько лет (в скрытой форме). Больной в этот период незаразен. При нелеченом сифилисе (в некоторых случаях), спустя много лет, может наступить поражение центральной нервной системы: при поражении головного мозга - прогрессивный паралич, при поражении спинного мозга - спинная сухотка. Эти заболевания возникают при локализации трепонем в мозговой ткани, что приводит к тяжелым органическим и функциональным изменениям в организме.
Иммунитет . Естественного иммунитета нет. При заболевании сифилисом развивается "нестерильный" инфекционный иммунитет. Его называют шанкерный, так как при повторном заражении твердый шанкр не образуется, но все последующие периоды развиваются. При сифилисе обнаруживают IgC и IgM, а также реагины IgE, которые в присутствии кардиолипидного антигена связывают комплемент.
Профилактика . Санитарно-просветительная работа, раннее выявление больных сифилисом. Специфическая профилактика. Не разработана.
Лечение . Пенициллин, бициллин, биохинол и др.
Контрольные вопросы
1. Опишите морфологию спирохет и методы окраски.
2. Что такое твердый шанкр?
3. Какой материал для исследования Вы будете брать в разные периоды заболевания сифилисом?
4. Каков иммунитет при сифилисе?
Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление бледной трепонемы и серодиагностика.
Материал для исследования
1. Содержимое твердого шанкра (первичный период).
2. Содержимое розеол, папул, везикул (вторичный период).
3. Кровь (вторичный, третий и четвертый периоды).
Основные методы исследования
1. Микроскопический.
2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).
3. Серологический: 1) реакция Вассермана (РСК);
2) осадочные реакции.
4. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ).
Серологическая диагностика
Реакция Вассермана . Реакцию ставят по принципу реакции связывания комплемента (табл. 52). Отличается она тем, что при реакции Вассермана может быть использован неспецифический антиген. Например, липоидный экстракт из бычьего сердца - кардиоантиген. Ввиду неспецифичности антител, реагирующих с этим антигеном, их называют реагинами. Реакция с неспецифическим антигеном объясняется тем, что в сыворотке крови больного повышается содержание глобулинов и изменяется степень их дисперсности. Глобулины, вступая в соединение с липидными экстрактами, образуют комплекс, который связывает комплемент, и поэтому гемолиз не происходит (в гемолитической системе). Отсутствие гемолиза - положительная реакция - серологически подтверждает диагноз "сифилис". При постановке серологических реакций нужно использовать также специфические антигены из тканевых трепонем и культуральные.
Примечание. 1) ++++ полная задержка гемолиза; - гемолиз; 2) антиген № 1 неспецифический (липоидная фракция бычьего сердца); 3) антигены № 2 и 3 специфические, приготовленные из культур трепонем.
Осадочные реакции . 1. Реакция Кана. Сыворотку больного инактивируют при 56° С 30 мин. К антигену (экстракт липидов бычьего сердца) прибавляют 0,6% холестерина для повышения чувствительности реакции (табл. 53).
Учет результата: появление преципитации отмечается как положительная реакция .
2. Реакция Закса - Витебского (цитохолевая осадочная реакция) является модификацией реакции Кана. Авторы применили более концентрированный антиген, к которому прибавлен холестерин, что способствует более быстрому образованию преципитата.
Реакция иммобилизации трепонем (РИТ) . Это наиболее специфичная реакция в диагностике сифилиса.
В настоящее время разработана методика этой реакции: взвесь трепонем получают из измельченного яичка кролика, зараженного Т. pallidum, и сохраняют в специальной среде, не угнетающей подвижность трепонем. В пробирку вносят 1,7 мл взвеси тканевых трепонем, добавляют 0,2 мл испытуемой сыворотки, 0,1 мл свежего комплемента.
Контроли: в 1-ю пробирку вместо испытуемой сыворотки вносят сыворотку здорового лица; во 2-ю - наливают инактивированную сыворотку морской свинки. Все пробирки помещают в эксикатор или анаэростат, заполняют их смесью газов (1 объем углекислоты и 19 объемов азота) и ставят в термостат при 35° С. Затем исследуемый материал наносят на стекло и изучают подвижность трепонем в темном поле. Принцип реакции заключается в том, что сыворотка больного сифилисом в присутствии комплемента угнетает движение бледной трепонемы. Определяют процент иммобилизованных трепонем.
Результат считают положительным, если иммобилизованных трепонем выше 50%; слабоположительным - от 30-50%; отрицательным - ниже 20%.
Контрольные вопросы
1. Какой материал используют для лабораторной диагностики сифилиса в разные периоды заболевания?
2. Каковы методы лабораторного исследования при диагностике сифилиса?
3. Какими антигенами нужно пользоваться при постановке реакции Вассермана?
4. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции иммобилизации трепонем (РИТ)? Какой материал берут у обследуемого, что в нем определяют?
У больных с подозрением на сифилис исследованию на бледную трепонему подлежат все высыпания, особен но эрозивные и язвенные на коже и слизистых оболочках полости рта, половых органов и заднего прохода. Если ис следование высыпных элементов невозможно или за труднено, то прибегают к пункции лимфатических узлов.
Бледная трепонема располагается в тканевых щелях, между волокнами соединительной ткани, вокруг лимфатических и кровеносных сосудов, в стенках и даже про светах лимфатических капилляров. Материалом, который необходим для бактериологического исследования на бледную трепонему, является тканевая жидкость (се рум). Для получения тканевой жидкости из высыпных элементов сифилиса существует несколько методов.
Перед взятием материала для исследования поверхность эрозивных или язвенных элементов предварительно осторожно очищают ватным или марлевым тампоном, смоченным в изотоническом растворе хлорида натрия, после чего осушают, не допуская травмирования во избе жание кровотечения.
Через некоторое время на поверхности исследуемого элемента начинает выделяться довольно обильная ткане вая жидкость. Если этого не происходит, то можно осто рожно поглаживать поверхность эрозии или язвы бактериологической петлей или металлической лопаткой. Тканевую жидкость для исследования можно получить также путем сдавливания (массажа) пальцами в резино вой перчатке подозрительной эрозии или язвы, а также путем создания относительного вакуума с помощью би ровской баночки. При отсутствии эрозирования или изъ язвления высыпаний материал для исследования можно получить путем скарификации их поверхности скальпе лем. Если проводилось местное лечение или трепонема не найдена, то следует назначить больному на несколько дней влажновысыхающие повязки из изотонического раствора хлорида натрия и затем производить повторное исследование.
Пункцию лимфатического узла осуществляют у больного в положении лежа с соблюдением всех правил асеп тики. Для пункции используют острую иглу с тупо сре занным концом и шприц с хорошо притертым поршнем. Игла и шприц должны быть сухими. Исследуемый лим фатический узел фиксируют I и II пальцами левой руки, а правой со шприцем и надетой на него иглой делают по слойный прокол кожи и лимфатического узла. Прокол делают по длинной оси узла, продвигают иглу до конца узла, слегка массируя его. Затем медленно выдвигают иглу назад, одновременно отсасывая шприцем содержи мое лимфатического узла. При так называемой «пункции с обогащением» рекомендуется ввести в корковый слой лимфатического узла 0,1–0,2 мл стерильного изотониче ского раствора хлорида натрия, движением поршня шприца промассировать узел и затем отсосать содержи мое. Пунктат лимфатического узла используют для ис следования на бледную трепонему по обычной методике, причем перед исследованием его желательно не смеши вать на предметном стекле с изотоническим раствором хлорида натрия.
Наилучшим методом обнаружения бледных трепонем для диагностики сифилиса является микроскопическое исследование нативных (естественных, влажных) препа ратов в темном поле. Исследование в темном поле основа но на феномене Тиндаля: если в темное помещение про пустить через узкую щель солнечный свет, то начинают ярко светиться мелкие пылинки, невидимые при обыч ном освещении. Это происходит оттого, что находящиеся в воздухе пылинки отражают солнечные лучи в разных направлениях и часть этих лучей попадает в наш глаз. При микроскопическом исследовании в темном поле ис пользуется специальный конденсор, направляющий лучи света от осветителя под очень малым углом к плоскости столика микроскопа, вследствие чего свет не попадает в окуляр микроскопа, и поле зрения является темным. Ис следуемый объект отражает свет и становится четко ви димым на темном фоне. Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать бледную трепонему в жи вом виде, а также дифференцировать ее от других трепо нем как по морфологическим признакам, так и по харак терным особенностям движения.
Для получения затемненного поля зрения при отсутствии специального конденсора можно пользоваться спосо бом М. П. Архангельского. Для этого между двумя линза ми конденсора Аббе на нижнюю линзу накладывают кружок из плотной черной бумаги с таким расчетом, что бы по краю линзы оставался просвет в 2–3 мм. Для того, чтобы кружок не смещался, по его краю оставляют при вырезании четыре выступа такой длины, чтобы они упи рались в металлическую оправу линзы.
Приготовление препарата для исследования в затемненном поле зрения производится следующим образом. Каплю серозного экссудата, полученного с поверхности исследуемого элемента, помещают в центре тонкого пред метного стекла, предварительно обезжиренного смесью равных частей спирта и эфира. Для исследования в темном поле предметные стекла должны быть не толще
1,1–1,2 мм, без царапин, совершенно чистыми. Капля с исследуемым материалом не должна выходить за преде лы покровного стекла. Рядом с каплей серозного экссуда та наносят равную по величине каплю изотонического раствора хлорида натрия; быстро смешав обе капли, по крывают их покровным стеклом.
В некоторых лабораториях, однако, с успехом микроскопируют только серозный экссудат без добавления изо тонического раствора. На верхнюю линзу темнопольного конденсора наносят каплю иммерсионного масла или дистиллированной воды, к которой прижимают приго товленный препарат. Микроскопию проводят с объекти вом 40 и окуляром 10 или 5.
Источник света устанавливают так, чтобы световой луч падал на зеркало микроскопа.
После того как препарат помещен на столик микроско па и установлен источник света, тубус микроскопа с объ ективом под контролем глаза осторожно опускают почти до покровного стекла. Затем поворотами зеркала добива ются наиболее яркого освещения поля зрения и после этого, не отрывая глаза от окуляра, очень осторожно под нимают тубус микроскопа до тех пор, пока не появится темное поле со светящимися в нем твердыми частицами, находящимися в броуновском движении. Среди них мо гут обнаруживаться отдельные нейтрофилы, лимфоциты, эпителиальные клетки. Если препарат сильно загрязнен этими элементами, то лучше приготовить новый препа рат. Бледная трепонема в темном поле зрения представ ляется в виде нежной спирали или тонкого нежного пунк тира. Она слабо преломляет свет и имеет серебристый оттенок. Важное значение имеет оценка характерных для бледной трепонемы движений. При микроскопии не сле дует смешивать с трепонемой нити фибрина - длинные
(с большими завитками) образования, производящие впечатление подвижных за счет тока жидкости. Большей частью они очень тонки и неравномерны по толщине.
Бледную трепонему следует дифференцировать от других трепонем, прежде всего встречающихся на поло вых органах и в полости рта. На половых органах необхо димо иметь в виду T. refringens. Она значительно толще бледной трепонемы, сильнее преломляет свет, имеет не многочисленные неравномерные, грубые, широкие, более покатые и менее глубокие завитки. Концы ее заострены, движения резкие, беспорядочные. Также следует отли чать от бледной трепонемы T. balanitidis, похожую на T. refringens, отличающуюся значительной длиной, тол щиной и имеющую 6–10 завитков.
При исследовании материала, взятого из полости рта, необходимо учитывать наличие здесь следующих трепонем:
1) T. microdentium (T. denticola) - она короче и, как правило, толще бледной трепонемы, завитки ее не сколько заострены, угловаты, она сильнее прелом ляет свет, выглядит ярче, перемещается медленнее, сгибательные движения редки;
2) T. buccalis обладает 3–10 широкими, плоскими, не равномерными завитками, сильно преломляет свет, оживленно движется, концы ее тупые;
3) T. vincenti (из фузоспириллезного симбиоза) пред ставляет собой тонкую и нежную трепонему с пло скими и неравномерными завитками, иногда имею щую 2–3 пологих завитка; движения ее активны, но беспорядочны, она светится ярче бледной трепоне мы.
Бледные трепонемы плохо окрашиваются анилино выми красителями, но восстанавливают нитрат серебра в металлическое серебро, которое откладывается на поверхности трепонем и делает их видимыми при микро скопии. На этом феномене основано обнаружение блед ных трепонем в тканях.
Метод Levaditi и Manouelian. Кусочки кожи или других органов, толщиной 1–2 мм фиксируют в 10% форма лине в течение 24–48 ч, промываются 96% этанолом в те чение 12–16 ч, затем промывают дистиллированной водой до погружения кусочков на дно сосуда. После этого проводится импрегнация 1% раствором нитрата серебра с
10% раствором пиридина. Кусочки выдерживают в этой смеси (в темной банке с притертой пробкой) 2–3 ч при комнатной температуре, а затем 4–6 ч при температуре
50 °С в термостате. Затем препараты быстро промывают в 10% растворе пиридина, после чего в течение нескольких часов проводится восстановление серебра 4% пиррогало вой кислотой с добавлением 10% очищенного ацетона и
15% раствора пиридина.
Метод Морозова - один из наиболее быстрых мето дов серебрения бледных трепонем, дающих вполне удов летворительные результаты [Овчинников Н.М. и др.,
1987]. Для окраски по методу Морозова необходимы следующие реактивы:
Реактив № 1 - 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40% раствора формалина и 100 мл дистиллированной воды;
Реактив № 2 - 5 г танина, 100 мл жидкой карболовой кислоты и 100 мл дистиллированной воды;
Реактив № 3 - раствор нитрата серебра (в 100 мл дис тиллированной воды растворяют 5 г кристаллического нитрата серебра; из этого количества в отдельный сосуд отливают 20 мл; к остальным 80 мл раствора нитрата се ребра по каплям прибавляют крепкий водный раствор аммиака, пока образующийся желто коричневый, а за тем буро черный осадок не растворится и не останется лишь легкая опалесценция; если добавление аммиака вовремя не прекращено, то из оставшихся 20 мл раство ра нитрата серебра приливают по каплям этот раствор до появления легкой опалесценции), для окраски реак тив разбавляют дистиллированной водой 1:10.
Импрегнация. Тонкий препарат высушивают на воздухе, но лучше в термостате. На 1 мин наливают на препарат реактив
№ 1, затем жидкость сливают, препарат обмывают водой. Протравливают реактивом № 2 при подогревании до появле ния паров (1 мин). Тщательно промывают водой, наливают реактив № 3, слегка подогревают в течение 1–2 мин, пока ре актив не станет темно коричневым. Препарат вновь тщатель но промывают водой и высушивают. Микроскопируют с им мерсионной системой.
При этом методе импрегнации трепонемы коричневые или почти черные, у них сохраняются морфологические особенности.
Препараты не подлежат длительному хранению.
Окраска по Романовскому - Гимзе. Фиксацию мазка осуществляют в смеси Никифорова (этанол и эфир в рав ных объемах). После испарения с мазка фиксирующей жидкости производят окраску препарата краской Рома новского - Гимзы, разведенной из расчета 2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. Для этого 10–15 мл раз веденной краски наливают в чашку Петри, на две стек лянные палочки мазком вниз опускают предметное стек ло и оставляют препарат для окрашивания на 2–5 ч, в зависимости от интенсивности окрашивающей способ ности раствора. После окончания окрашивания предмет ное стекло с мазком осторожно промывают боковой струей воды. Высушивают препарат при комнатной температу ре. Микроскопическое исследование проводят в иммер сионной системе. При окраске препаратов по методу Ро мановского - Гимзы бледная трепонема приобретает розовый или розовато фиолетовый цвет, в то время как другие трепонемы окрашиваются в интенсивно синева тые тона.
Treponema – род бактерий, объединяющий многочисленные виды, из которых самым распространенным является возбудитель сифилиса – treponema pallidum (трепонема паллидум, бледная трепонема). В этот род также входят возбудители фрамбезии и пинты. Treponema pallidum является спиралевидной бактерией семейства Spirochaetiaceae (спирохеты), вызывающей инфекционное венерическое заболевание - . Патология отличается волнообразным течением и проявляется характерной клиникой. Заражение происходит преимущественно половым путем, благодаря чему сифилис относится к ИППП.
В настоящее время в мире регистрируется огромное количество венерических заболеваний, которые представляют реальную угрозу для жизни человека. Treponema pallidum – опасный микроб, вызывающий системное заболевание, поражающее кожу и внутренние органы. На месте внедрения спирохеты образуется первичный патологический очаг – . Затем на коже появляются сифилитические высыпания, увеличиваются регионарные лимфатические узлы. При отсутствии адекватной терапии поражаются внутренние органы, развиваются необратимые изменения, возможен летальный исход.
Treponema pallidum
Морфология
Treponema pallidum - грамотрицательный микроорганизм, имеющий форму тонкой спирали, скрученной в 8-12 мелких завитков. Свое название бледная трепонема получила благодаря способности не воспринимать обычные лабораторные красители.
Спирохета является строгим анаэробом, хорошо растущим в бескислородной среде. Но не смотря на это, жизнеспособность бактерий сохраняется на окружающих бытовых предметах в течение 3 и более дней. Трепонема имеет жгутики и фибриллы. Благодаря им и собственным сокращениям клетки бактерия совершает поступательные, вращательные, сгибательные, волнообразные, винтообразные и контрактильные движения. Она быстро проникает в живые клетки и стремительно размножается в них поперечным делением.
Бледная трепонема имеет трехслойную клеточную стенку, цитоплазму и органеллы: рибосомы, мезосомы, вакуоли. Рибосомы синтезируют белки, а мезосомы обеспечивают дыхание и обмен веществ. Ферменты и антигены содержатся в цитоплазматической мембране. Тело бактерии покрыто слизистой бесструктурной капсулой, выполняющей защитную функцию.
Физические свойства
Микробы устойчивы к низким температурам и чувствительны к высоким. При нагревании они гибнут в течение 20 минут, при высыхании в течение 15 минут, а при кипячении – мгновенно. Антисептики и дезинфектанты быстро уничтожают бледную трепонему. Губительное действие на бактерию оказывают: ультрафиолет, свет, спирт, щелочи, уксус, мышьяк, ртуть, хлорсодержащие дезинфицирующие средства. Treponema pallidum устойчива к некоторым антибиотикам.
Бледная трепонема проявляет свои патогенные свойства во влажной и теплой среде. В организме человека излюбленным местом размножения являются лимфатические узлы. На стадии вторичного сифилиса микробы концентрируются в крови и проявляют свои патогенные свойства.
Культуральные свойства
Трепонема паллидум не растет на искусственных питательных средах, в культуре клеток и куриных эмбрионах. Ее культивируют в яичках кролика. В этих клетках микроб хорошо растет и размножается, полностью сохраняя свои свойства и вызывая у животного орхит.
Существуют обогащенные питательные среды, предназначенные для выделения чистой культуры. Микробы на них растут под толстым слоем вазелинового масла. Таким способом получают антитела, необходимые для постановки специфических реакций на сифилис.
Трепонемы растут на кровяном или сывороточном агаре в бескислородной среде. При этом они теряют свои патогенные свойства, но сохраняют антигенные. Патогенные трепонемы способны ферментировать маннит, утилизировать лактат и образовывать специфические метаболиты.
Патогенность
К факторам и компонентам патогенности и вирулентности бактерий относятся:
- Белки-адгезины, обеспечивающие фиксацию микроба на клетке-хозяина,
- Миофибриллы, способствующие глубокому проникновению в организм и миграции бактерии в теле хозяина,
- Образование L-форм,
- Липополисахариды наружной мембраны,
- Фрагменты болезнетворной клетки, проникающие вглубь тканей,
- Способность внедряться в межклеточные соединения эндотелия,
- Антигенная изменчивость.
Трепонема паллидум оказывает прямое токсическое действие на синтез макромолекул – ДНК, РНК и белков. Антигены Т. pallidum используются в реакции Вассермана для серодиагностики сифилиса. При неблагоприятных условиях спирохета трансформируется в L-формы, которые обеспечивают ее устойчивость к антибактериальным средствам и антителам.
Эпидемиология
Сифилис - строгий антропоноз. Инфекция персистирует только в организме человека, который является ее естественным резервуаром в природе. Входными воротами инфекции являются: поврежденный плоскоклеточный или цилиндрический эпителий ротовой полости или половых органов.
Распространение инфекционных агентов происходит:
- Половым путем во время полового акта через сперму,
- Бытовым путем через белье, средства гигиены, косметические принадлежности, при поцелуе,
- Вертикальным путем от инфицированной матери ребенку во время родов, а также через молоко при кормлении грудью,
- Трансплацентарным путем на поздних сроках беременности,
- Гематогенным путем при прямом переливании крови, во время операций, при использовании общего шприца у наркоманов.
Риск инфицирования повышен у медицинских работников – стоматологов, косметологов. Заражение происходит при проведении медицинских манипуляций и процедур, повреждающих кожные покровы. Заражаются treponema pallidum лица, ведущие беспорядочную половую жизнь, имеющие несколько половых партнеров, пренебрегающие барьерными методами контрацепции. Для того, чтобы произошло инфицирование, у больного в секрете должно быть много бактерий, а у партнера - должны присутствовать повреждения на слизистой оболочке.
первые проявления болезни
Больной максимально заразен в периоды первичного и вторичного сифилиса, когда на коже и слизистой половых органов появляются первые признаки болезни. В это время в окружающую среду выделяется много спирохет.
В настоящее время регистрируется большое число больных с экстрагенитальными шанкрами, расположенными на слизистой рта, глотки, ануса. У них высыпания локализуются на лице, сифилиды – на ладонях и подошвах. Третичный период сифилиса в последнее время развивается в очень редких случаях и протекает практически бессимптомно.
Симптоматика
Инкубация характеризуется миграцией бактерий по лимфатическим и кровеносным сосудам и их активным размножением в лимфоузлах. Продолжительность периода - от 3 недель до 3 месяцев.
Врожденный сифилис развивается в результате внутриутробного заражения плода. Эта тяжелейшая патология проявляется характерной триадой симптомов у ребенка: врожденной глухотой, кератитом, гетчинсоновыми зубами.
Диагностика
Диагностика сифилиса включает опрос и осмотр пациента, сбор анамнестических сведений, а также клинические испытания, которые играют важную роль в обнаружении бледной трепонемы и постановке диагноза.
- Микроскопическое исследование биоматериала. Бактериоскопию мазка-отпечатка шанкра или биоптата лимфатического узла проводят в первые 4 недели болезни. Для получения качественного мазка поверхность эрозии и язвы обрабатывают физраствором, производят соскоб и из полученного материала готовят препарат для микроскопии. Мазок окрашивают по Романовскому-Гимзе. Трепонема имеет бледно-розовый цвет. Живые микробы в неокрашенном и нефиксированном мазке не видны в световой микроскоп. Для их обнаружения применяют темнопольную или фазовоконтрастную микроскопию. Для проведения темнопольной микроскопии берут материал из сифилитической язвы и исследуют его в специальном аппарате. Бактерия обладает способностью преломлять свет: в микроскопе она имеет вид белой спиралевидной полоски. Для обнаружения трепонем в различных клинических материалах применяется также люминесцентная микроскопия.
Лечение
Лечением сифилиса занимается врач-дерматовенеролог. Он подбирает терапию индивидуально с учетом стадии, клиники болезни и особенностей пациента. Комплексное лечение способствует полному выздоровлению, которое должно подтверждаться лабораторно.
Лечение сифилиса этиотропное, направленное на уничтожение возбудителя – treponema pallidum. Больным назначают большие дозы антибиотиков, к которым чувствителен данный микроб. Обычно используют пенициллины «Бензилпенициллин», тетрациклины «Доксициклин», макролиды «Кларитромицин», «Сумамед», цефалоспорины «Цефазолин», фторхинолоны «Ципрофлоксацин». Антибактериальную терапию продолжают 2 месяца. Лечение беременных женщин проводят также.
Иммуностимуляция, витаминотерапия, физиопроцедуры дополняют этиотропное лечение и помогают больным восстановиться после болезни. Превентивная терапия проводится половому партнеру и лицам, контактировавшим с больным.
Видео: дерматовенеролог о лечении сифилиса
Профилактика
Профилактические мероприятия заключаются в соблюдении личной гигиены, использовании отдельного белья и посуды, индивидуальных косметических средств. Рекомендуется сразу после незащищенного полового акта обработать раствором хлоргексидина или альбуцида половые органы или другие части тела, с которыми произошел контакт. Эти средства необходимо иметь в домашней аптечке.
С профилактической целью обследуют:
- Доноров,
- Беременных женщин,
- Работников детских садов, школ, общепита и лечебно-профилактических учреждений,
- Больных, поступающих на стационарное лечение.
Современная противомикробная терапия позволяет избавиться от патологии и делает прогноз заболевания благоприятным. Только врач-дерматовенеролог сможет подобрать правильное и достаточное лечение, соответствующее стадии болезни. Заниматься самолечением сифилиса категорически запрещено. Не до конца излеченная патология может перейти в хроническую форму. Такой больной опасен для окружающих лиц.
Сифилис – социальный недуг, к лечению которого нужно подходить серьезно и ответственно.
Видео: сифилис в программе “Здоровье”
